Validación y evaluación de una prueba de RT-PCR en tiempo real in house para la detección de SARS-CoV-2 usando un gen específico RdRp y control endógeno GAPDH / Validation and evaluation of RT-PCR real time in house test to detection of SARS-CoV-2 using specific RdRp gene and GAPDH endogen control

RESUMEN Se validó y evaluó un método de RT-PCR en tiempo real usando cebadores y sondas específicas para los genes RdRP de SARS-CoV-2 y GAPDH de humanos; este último fue usado como control endógeno. Se evaluó la especificidad y sensibilidad; además, se evaluó otros parámetros como la robustez, la repetibilidad, reproducibilidad, comparabilidad y el límite de detección. La sensibilidad, especificidad, los valores predictivos positivo y negativo, la robustez, comparabilidad y la repetibilidad-reproducibilidad de la prueba de RT-PCR en tiempo real dúplex fue de 100%, con un límite de detección de 100 copias/µL, de acuerdo con los criterios de aceptación establecidos para validación del protocolo. Esta prueba estandarizada es una buena alternativa para el diagnóstico de COVID-19; además, la prueba fue aplicada de manera exitosa en personas sospechosas de la enfermedad permitiendo controlar el número de falsos negativos.

ABSTRACT The present work validated and evaluated a duplex real-time RT-PCR using specific primers and probes for genes RdRp from SARS-CoV-2 and GAPDH from humans; the latter was used as an endogenous control in all reactions. We evaluated the specificity, the sensitivity, the robustness, the reproducibility, the repeatability, the comparability, and the limit of detection. The predictive positive and negative values (PPV and PNV, respectively) and all the parameters evaluated using our duplex real-time RT-PCR was 100%. The detection limit was 100 copies/µL according to the acceptance criteria established for the validation of this protocol. Our duplex real-time RT-PCR demonstrated to be a good alternative for the diagnosis of COVID-19; in addition, this PCR was used adequately in suspicion of COVID-19, allowing it to control the number of false-negatives.

Validation and evaluation of RT-PCR real time in house test to detection of SARS-CoV-2 using specific RdRp gene and GAPDH endogen control. / Validación y evaluación de una prueba de RT-PCR en tiempo real in house para la detección de SARS-CoV-2 usando un gen específico RdRp y control endógeno GAPDH.

The present work validated and evaluated a duplex real-time RT-PCR using specific primers and probes for genes RdRp from SARS-CoV-2 and GAPDH from humans; the latter was used as an endogenous control in all reactions. We evaluated the specificity, the sensitivity, the robustness, the reproducibility, the repeatability, the comparability, and the limit of detection. The predictive positive and negative values (PPV and PNV, respectively) and all the parameters evaluated using our duplex real-time RT-PCR was 100%. The detection limit was 100 copies/µL according to the acceptance criteria established for the validation of this protocol. Our duplex real-time RT-PCR demonstrated to be a good alternative for the diagnosis of COVID-19; in addition, this PCR was used adequately in suspicion of COVID-19, allowing it to control the number of false-negatives.

Se validó y evaluó un método de RT-PCR en tiempo real usando cebadores y sondas específicas para los genes RdRP de SARS-CoV-2 y GAPDH de humanos; este último fue usado como control endógeno. Se evaluó la especificidad y sensibilidad; además, se evaluó otros parámetros como la robustez, la repetibilidad, reproducibilidad, comparabilidad y el límite de detección. La sensibilidad, especificidad, los valores predictivos positivo y negativo, la robustez, comparabilidad y la repetibilidad-reproducibilidad de la prueba de RT-PCR en tiempo real dúplex fue de 100%, con un límite de detección de 100 copias/µL, de acuerdo con los criterios de aceptación establecidos para validación del protocolo. Esta prueba estandarizada es una buena alternativa para el diagnóstico de COVID-19; además, la prueba fue aplicada de manera exitosa en personas sospechosas de la enfermedad permitiendo controlar el número de falsos negativos.

Neutralization of the lethal activity from Bothrops atrox venom by hyperimune llama serum (Lama glama). / Neutralización de la actividad letal del veneno de serpiente Bothrops atrox por suero hiperinmune de llama (Lama glama).

OBJECTIVES: To evaluate the capacity of the hyperimmune llama serum (Lama glama) to neutralize the lethal activity of Bothrops atrox venom in laboratory mice. MATERIALS AND METHODS: Mean lethal dose (LD50) was calculated from a Bothrops atrox venom sample pool from Peru. The antibody titers were measured by ELISA assay; and the immune serum neutralization potency was measured by calculating the mean effective dose (ED50) during the immunization period. RESULTS: The venom's LD50 was 3.96 µg/g; similar to what was found in other studies about Bothrops atrox carried out in Peru. The titers of antibodies against the venom increased rapidly in the llama, demonstrating a fast immune response; however, the neutralization capacity increased slowly and required several doses and immunization reinforcements, obtaining a ED50 of 3.30 µL/g mouse and a neutralization potency of 3.6 mg/mL after 15 immunizations. CONCLUSIONS: The hyperimmune llama serum is able to neutralize the lethality of the Bothrops atrox venom from Peru in laboratory mice.

OBJETIVOS: Evaluar la capacidad del suero hiperinmune de llama (Lama glama) para neutralizar la letalidad del veneno de la serpiente Bothrops atrox en ratones de laboratorio. MATERIALES Y MÉTODOS: Se calculó la dosis letal media (DL50) de un pool de venenos de serpientes de Bothrops atrox de Perú, y se midieron los títulos de anticuerpos por ensayo ELISA; así como la potencia de neutralización del suero inmune por el cálculo de la dosis efectiva media (DE50) durante el periodo de inmunización. RESULTADOS: La DL50 del veneno fue de 3,96 µg/g, similar a otros trabajos realizados en Bothrops atrox en Perú. Los títulos de anticuerpos contra el veneno se incrementan rápidamente en la llama mostrando una rápida respuesta inmune; sin embargo, la capacidad de neutralización se incrementa más lentamente y requiere de varias dosis y refuerzos de las inmunizaciones alcanzado una DE50 de 3,30 µL/g ratón y una potencia de neutralización 3,6 mg/mL después de 15 inmunizaciones. CONCLUSIONES: El suero hiperinmune de llama es capaz de neutralizar la letalidad del veneno de la serpiente Bothrops atrox de Perú en ratones de laboratorio.

Population genetic study of a Peruvian population using human identification STRs.

In this study, allele frequencies were determined in a Peruvian population for application to human identification. A population of 601 unrelated individuals was analyzed (400 individuals with the GlobalFiler Express kit and 201 individuals with the VeriFiler Express kit). The locus with the highest power of discrimination (PD) was SE33 (0.9851, 31 alleles), while the least polymorphic locus was D22S1045 (0.75810, 11 alleles). The PE in a similar fashion ranged from 0.2421 (D22S1045) to 0.7818 (SE33). Under the assumption of independence, the combined PD was > 0.9999999999 while the combined PE = 0.9999999933. When comparing the population studied with different populations of Latin America, the greatest Fst genetic distance was obtained with a Venezuelan population (0.052), and the shortest distance was with a Bolivian and Peruvian population (0.004).

Neutralización de la actividad letal del veneno de serpiente Bothrops atrox por suero hiperinmune de llama (Lama glama) / Neutralization of the lethal activity from Bothrops atrox venom by hyperimune llama serum (Lama glama)

RESUMEN Objetivos: Evaluar la capacidad del suero hiperinmune de llama (Lama glama) para neutralizar la letalidad del veneno de la serpiente Bothrops atrox en ratones de laboratorio. Materiales y métodos: Se calculó la dosis letal media (DL50) de un pool de venenos de serpientes de Bothrops atrox de Perú, y se midieron los títulos de anticuerpos por ensayo ELISA; así como la potencia de neutralización del suero inmune por el cálculo de la dosis efectiva media (DE50) durante el periodo de inmunización. Resultados: La DL50 del veneno fue de 3,96 µg/g, similar a otros trabajos realizados en Bothrops atrox en Perú. Los títulos de anticuerpos contra el veneno se incrementan rápidamente en la llama mostrando una rápida respuesta inmune; sin embargo, la capacidad de neutralización se incrementa más lentamente y requiere de varias dosis y refuerzos de las inmunizaciones alcanzado una DE50 de 3,30 µL/g ratón y una potencia de neutralización 3,6 mg/mL después de 15 inmunizaciones. Conclusiones: El suero hiperinmune de llama es capaz de neutralizar la letalidad del veneno de la serpiente Bothrops atrox de Perú en ratones de laboratorio.

ABSTRACT Objectives: To evaluate the capacity of the hyperimmune llama serum (Lama glama) to neutralize the lethal activity of Bothrops atrox venom in laboratory mice. Materials and methods: Mean lethal dose (LD50) was calculated from a Bothrops atrox venom sample pool from Peru. The antibody titers were measured by ELISA assay; and the immune serum neutralization potency was measured by calculating the mean effective dose (ED50) during the immunization period. Results: The venom's LD50 was 3.96 μg/g; similar to what was found in other studies about Bothrops atrox carried out in Peru. The titers of antibodies against the venom increased rapidly in the llama, demonstrating a fast immune response; however, the neutralization capacity increased slowly and required several doses and immunization reinforcements, obtaining a ED50 of 3.30 μL/g mouse and a neutralization potency of 3.6 mg/mL after 15 immunizations. Conclusions: The hyperimmune llama serum is able to neutralize the lethality of the Bothrops atrox venom from Peru in laboratory mice.

Development of Nanobodies Against Hemorrhagic and Myotoxic Components of Bothrops atrox Snake Venom.

Snake envenoming is a globally neglected public health problem. Antivenoms produced using animal hyperimmune plasma remain the standard therapy for snakebites. Although effective against systemic effects, conventional antivenoms have limited efficacy against local tissue damage. In addition, potential hypersensitivity reactions, high costs for animal maintenance, and difficulties in obtaining batch-to-batch homogeneity are some of the factors that have motivated the search for innovative and improved therapeutic products against such envenoming. In this study, we have developed a set of nanobodies (recombinant single-domain antigen-binding fragments from camelid heavy chain-only antibodies) against Bothrops atrox snake venom hemorrhagic and myotoxic components. An immune library was constructed after immunizing a Lama glama with whole venom of B. atrox, from which nanobodies were selected by phage display using partially purified hemorrhagic and myotoxic proteins. Biopanning selections retrieved 18 and eight different nanobodies against the hemorrhagic and the myotoxic proteins, respectively. In vivo assays in mice showed that five nanobodies inhibited the hemorrhagic activity of the proteins; three neutralized the hemorrhagic activity of whole B. atrox venom, while four nanobodies inhibited the myotoxic protein. A mixture of the anti-hemorrhagic and anti-myotoxic nanobodies neutralized the local tissue hemorrhage and myonecrosis induced by the whole venom, although the nanobody mixture failed to prevent the venom lethality. Nevertheless, our results demonstrate the efficacy and usefulness of these nanobodies to neutralize important pathologies of the venom, highlighting their potential as innovative therapeutic agents against envenoming by B. atrox, a viperid species causing many casualties in South America.

Prueba molecular genotype MTBDRplus, una alternativa para la detección rápida de tuberculosis multidrogorresistente / Molecular test genotype MTBDRplus, an alternative to rapid detection of multidrug resistance tuberculosis

La prueba molecular Genotype MTBDRplus, es un método que permite identificar las mutaciones más frecuentes asociadas con la resistencia a las drogas antituberculosas de primera línea: isoniacida (INH) y rifampicina (RIF). El objetivo de este estudio fue evaluar el desempeño de la prueba molecular con cultivos y muestras de esputo con baciloscopía positiva. Se evaluó 95 cultivos y 100 esputos con perfiles de resistencia previamente determinados por el método de referencia “proporciones agar en placa” (APP). La prueba molecular a partir de cultivos mostró una sensibilidad de 100 por ciento;97,5 por ciento y 96,9 por ciento para RIF, INH y multidrogorresistente (MDR) respectivamente; mientras que para esputo la sensibilidadfue de 95,7 por ciento; 96,8 por ciento y 95,2 por ciento para RIF, INH y MDR respectivamente. Se concluye que Genotype MTBDRplus es una herramienta muy útil para la detección rápida de la resistencia a INH y RIF simultáneamente (MDR) en un máximo de72 h a partir de esputo o de cultivo

Variabilidad genética de Aedes Aegypti en algunas áreas del Perú usando single stranded comformational polymorphism (SSCP) / Genetic variability of Aedes aegypti in some Peruvian areas using Single Stranded Conformational Polymosphism (SSCP)

Aedes aegypti es el vector responsable de la transmisión del virus del dengue, su distribución geográfica se haampliado rápidamente debido principalmente a la intervención de los seres humanos. Objetivo: Analizar la variabilidad genética de este mosquito mediante la comparación del Segundo Espaciador Transcrito Interno (ITS 2) perteneciente al ADN ribosomal (rADN). Materiales y Métodos: Se analizaron muestras de ocho localidades (Jaén, Tingo María, Iquitos, Lambayeque, el distrito de El Rimac, Sullana y Zarumilla) y uno de la provincia de Huaquillas (Ecuador). El análisis de la variabilidad se determinó usando la técnica conocida como SSCP (Single Stranded Conformation Polymorphism). Resultados: El estudio muestra que existe variabilidad genética entre las poblaciones analizadas, principalmente entre las muestras localizadas en la costa del Perú (Zarumilla, El Rímac, Sullana) y Huaquillas y las muestras del nororiente (Tingo María, Iquitos, Jaén y Lambayeque) Conclusión: Se determinaron dos variantes genéticas entre las poblaciones de Aedes aegypti: Costeña y Nororiental, que probablemente provienen de dos ancestros diferentes y cuyo ancestro común sufrió de aislamiento por distancia. Se observó que no existe relación entre las distancias genéticas y las distancias geográficas indicando que la migración de estas poblaciones es el resultado de la intervención de los seres humanos que diseminan al vector y no por la migración activa del mosquito. Se plantea el papel de la Cordillera de los Andes en la migración y separación de las poblaciones de Aedes.

Aedes aegypti is the responsible vector for transmission of dengue fever virus, and its geographical distribution has been widely broadened, mainly because of human intervention. Objectives: To analyze the mosquito genetic variability comparing the Second Internal Trascribed Spacer (ITS-2) from the ribosomal DNA (rDNA). Materials and Methods: Samples from seven Peruvian sites (Jaen, Tingo Maria, Iquitos, Lambayeque, Rimac district in Lima, Sullana, and Zarumilla) and one site from Ecuador (Huaquillas Province) were assessed. Variability analysis was determined using the SSCP (Single-Stranded Conformational Polymorphism) technique. Results: The study shows that there are genetic variability between the analyzed populations, mainly between the samples from the Peruvian northern and central coast (Zarumilla, Sullana, and Rímac) as well as in the Ecuador sample (Huaquillas) and the samples from the northeastern region in Peru (Tingo Maria, Iquitos, Jaen, and Lambayeque). Conclusions: Two genetic variants were determined for Aedes aegypti populations: Coastal and northeastern, which probably come from different lineages, and whose common ancestor became isolated because of the distance. It was observed that there is no relationship between genetic distances and geographical distances, indicating that the migration of the mosquito populations is a consequence of human intervention disseminating the vector and not because of active mosquito migration. We propose that there is a role for the Andes Mountains with respect to Aedes populations migration and separation.

Escherichia coli enteroagregativa en niños con diarrea de un hospital de Lima / Enteroaggregative escherichia coli in children with diarrhea in a Lima hospital

Entre las Escherichia coli diarreogénicas la categoría E. coli enteroagregativa (ECEA) es una de las más importantes y frecuentemente asociada a diarreas infantiles. El presente estudio se realizó con la finalidad de detectar los factores de virulencia que caracterizan a esta categoría patogénica mediante hibridación por colony blot usando sondas de ADN específicas. Se evaluaron 233 cepas aisladas en el laboratorio del Hospital de Emergencias Pediátricas durante los meses de diciembre 1998 y abril de 1999. Del total de muestras analizadas, se encontró que 17,16 por ciento de las cepas poseen el factor de virulencia característico de esta categoría. Los resultados obtenidos demuestran que un importante número de aislamientos de niños con diarrea presentan E. coli enteroagregativa.

Amongst Escherichia coli causing diarrheal disease, enteroaggregative E. coli is one of the most important organisms, and it is frequently associated to diarrhea in infants. The study was performed aiming at detecting virulence factors for the aforementioned organism, using colony blood hybridization with specific deoxyribonucleic acid (DNA) probes. 233 samples isolated in the Pediatric Emergency Hospital Laboratory between december 1998 and april 1999. Of all samples analyzed, it was found that 17,16 per cent of them have the typical virulence factor for their category. The resultsprove that an important proportion of isolates in children with diarrheal disease have enteroaggregative E. coli.